Examen: Detección de ADN de Virus Papiloma Humano (VPH) por PCR y Tipificación del ADN de VPH por RFLP.

Abreviatura del ensayo: VPH-PCR / VPH-RFLP

Muestra requerida: Hisopado genital (uretra, vagina, cuello y glande), orina,tejidos ( Biopsia fresca y parafina)

Conservación y envió de la muestra:

Orina, hisopado genital conservar y enviara4º C en contenedor estéril. La muestra de orina debe tener al menos5 ml de material, menos volumen disminuye la sensibilidad del ensayo.

Biopsias fresca: conservar y enviar a 4º C en buffer lisis suministrado por el laboratorio. En caso de no contar con buffer lisis, conservar en congelacióna -20º C y enviar con hielo seco.

Biopsias parafinadas: conservar y enviar a temperatura ambiente

Nota: El envió de muestras debe realizarse en condiciones seguras, en cavas bien selladas para evitar riesgos biológicos al personal de la cadena de transporte.

Condiciones Inaceptables: Hisopados o muestras en algún otro medio de transporte.

Entrega de resultados: 7 días hábiles los hisopados y 10 días hábiles las biopsias.

Negativo: No se detecta ADN de VPH.

Positivo: Detección de ADN de VPH.

Genotipaje de VPH:

- Tipo 6,11,40, 42,43, 44 y 57(considerado de bajo riesgo) y

- Tipo 30, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 58, 59 y 60 (considerado de riesgo intermedio)

- Tipo 16, 18, 56 y 68 (considerado de alto riesgo)

Interpretación de los resultados:

Un resultado positivo de VPH de alto riesgo indica que el paciente puede estar infectado con los genotipos del VPH (16, 18, 56, y 68)los cuales están asociados con cáncer cervical y lesiones precursoras de esta. Las infecciones mixtas con otros genotipos pueden ocurrir, los resultados siempre deben correlacionarse con la citología

Un resultado positivo de VPH de riesgo intermedio (30, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 58, 59 y 60) indica frecuentemente lesionesintraepitelialesescamosas(LIE) de alto grado pero menos frecuente a cáncer cervical invasivo.
Un resultado positivo de VPH de bajo riesgo (6,11,40, 42,43, 44 y 57) índica lesiones asociadas a condilomas planos o exofíticos.
La tipificación de VPH esta concebida para su utilización como una prueba complementaria y en ningún caso como criterio único de diagnóstico, por tanto en conjunto con los estudios citológicos e histológicos, es muy efectivo para predecir la progresión de las lesiones cervicales, diferenciando aquellos que significan un riesgo elevado o intermedio de los que implican un riesgo bajo con relación al cáncer.

El ensayo ha sido validado por Laboratorio Genomik CA con controles positivos y negativos comerciales; sin embargo un resultado negativo no excluye la presencia de ADN de VPH por debajo del limite de sensibilidad del ensayo, ni la posible presencia de inhibidores de la reacción de PCR.

¿A quien esta dirigida la prueba?

La prueba de detección de VPH esta dirigida a la mujer principalmente una vez que inicia su vida sexual activa, y debe repetirse periódicamente, sobretodo si cambia frecuentemente de pareja.

Metodología:

-Extracción de ADN de la muestra mediante estuches comerciales.

-PCR usando cebadores seleccionado en el fragmento abierto de lectura L1 ORF, descrito por Volker, et al. 1996 y Coutlee y cols 2002.

-Visualización de amplicones en gel de agarosa y coloración por bromuro de etidio.

-Controles positivos: Células Hela (VPH 18) y SiHa (VPH16)

Confiabilidad de la prueba

La misma esta garantizada por la utilización de sofisticados sistemas para la prevención de las contaminaciones, además de la incorporación de un control interno de cada prueba para evitar la aparición de falsos negativos. La alta sensibilidad y especificidad del PCR hace posible la detección y tipificación del virus en una etapa muy temprana de la infección aun cuando todavía no hay anomalías citológicas; en las pacientes infectadas es importante realizar pruebas citológicas dirigidas por colposcópia en lo posible. La prueba de detección de VPH debe integrarse al arsenal clásico de los laboratorios de Anatomía Patológica para facilitar el manejo de los casos con lesiones difíciles de clasificar histológicamente.

Significado clínico:

La infección de Virus de Papiloma Humano (VPH) se transmite frecuentemente por contacto sexual y su prevalecia es sumamente elevada, millones de miles de infecciones por VPH ocurren cada año. El VPH esta directamente implicado en el desarrollo de condilomas y lesiones intraepiteliales escamosas (LIE) siendo identificado comofactor de riesgo presente en más del 90% de los casos diagnosticados con cáncer del cuello uterino.

El VPH es un virus con genoma circular que presenta un ácido desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena, que infecta selectivamente las células epiteliales. La forma clínica se manifiesta generalmente como lesiones planas o verrugosas, blanquecinas, o espiculares en zonas húmedas genitales especialmente, visibles a la vista, pero también puede darse la forma subclínica en donde la lesión pueden ser planas o de diferentes formas topográficas (atípicas), que solo son visibles por colposcópia, y en aquellos casos donde la lesión en el tejido esta ausente, fase denominada infección latente u oculta, solo pueden ser diagnosticadas por aislamiento del ADN de las célulasdonde el VPH se ha replicado.

El grado de lesión esta relacionada con genotipos específicos de VPH.Existen más de 100 genotipos y aproximadamente 40 pueden afectar el tracto genital.

Referencias Bibliografia:

-Contorni, M. Et al. Typing of human papillomavirus DNAs by restriction endonuclease mapping of the PCR products. J. of Virological Methods. 1993; 41:29-36.

-Coutlee F, Gravitt P, Kornegay J, Hankins C, Richardson H, Lapointe N, Voyer H, Franco E. Use of PGMY primers in L1 consensus PCR improves detection of human papillomavirus DNA in genital samples.J Clin Microbiol. 2002 Mar;40(3):902-7.

-Fields Virologyby Bernard N. Fields, Peter M., MD Howley, Diane E., Ph.D. Griffin, Robert A., Ph.D. Lamb, Malcolm A., MD Martin, Bernard Roizman, Stephen E., MD Straus, David M., Ph.D. Knipe, FOURTH EDITION, July 2001.

-González, F y Martínez, B. Técnicas Instrumentales en Genética Forense. Institución “Fernando el Católico”Colección “Orfila Rotger” de Ciencias Forense, 2001; 56-57.

-PVHfast, Detectión y tipado de Papillomavirus humano mediante identificación genómica, Pharma Gen S.A.

-Pizzighella, S. et al. Simultaneous polymerase Chain reaction detection and restriction typing for the diagnosis of human genital papillomavirus infection. J. of Virological Methods. 1995; 55:245-256.

-Schneider A. Natural history of genital papillomavirus infections.Intervirology1994, 37: 201-214.

-Vossler, J. et al. Evaluation of the Polymerase Chain Reaction for the Detection of Human Papilomavirus From Urine. J Medical Virology 1995; 45:354-360.

-Volker Adams, Moll Carlo, Mirka Schmid, Celestino Rodrigues, Rita Moos, and Jakob Briner. Detection and Typing of Human Papillomavirus in Biopsy and Cytological Specimens by Polymerase Chain Reactionand Restriction Enzyme Analysis: a method suitable for semiautomation. J Med Virol. 1996 Feb;48(2):161-70.

-Kornegay JR, Shepard AP, Hankins C, Franco E, Lapointe N, Richardson H, Coutlee F; Canadian Women's HIV Study Group.

-Nonisotopic detection of human papillomavirus DNA in clinical specimens using a consensus PCR and a generic probe mix in an enzyme-linked immunosorbent assay format. J Clin Microbiol. 2001 Oct;39(10):3530-6.